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玉米轉錄因子導入擬南芥研究鎘離子脅迫耐受機制

合作老師:華南植物園 賀立龍

文章下載鏈接:http://www.bfsdvm.live/uploads/tmp/genedenovo-resume-1467363955.1458149.pdf

基迪奧新文章,研究玉米轉錄因子在擬南芥鎘離子脅迫耐受中的調控機制。發表在Plant Physiology雜志上,IF 6.84。

研究背景

鎘離子是土壤重金屬污染的其中一種,會影響植物生長,并且長期慢性攝入鎘離子會造成很多健康問題,如癌癥、心血管疾病等。因此,研究農作物對鎘離子脅迫的耐受機制,有助于我們進行作物改良。
之前有報道指出,氧化應激蛋白(oxidative stress 2,OXS2)在擬南芥壓力應激和壓力逃避方面發揮重要作用。其中,在壓力逃避方面,OXS2通過激活下游一些開花基因如SOC1,從而促進植物繁殖、保證植物生存。但OXS2是如何激活壓力耐受信號通路卻不清楚。
由于本文作者主要是想研究玉米這種經濟作物,因此選擇轉基因的方法,在模式生物擬南芥中研究與鑒定OXS2激活下游信號通路的靶基因。

文章總體研究思路

研究結果
1. Blast比對預測擬南芥OXS2基因在玉米中的兩個同源基因
結果:找到了兩個同源基因:ZmOXS2b和ZmO2L1,并且這兩個基因在鎘離子處理下的玉米中表達量上調了2-3倍,說明這兩個同源基因可響應鎘離子脅迫。

2. 將玉米同源基因導入擬南芥中,并檢測其對鎘離子的耐受性
將ZmOXS2b和ZmO2L1轉基因導入野生型擬南芥和oxs2-1、o2l1-1突變體中,并檢測四株轉基因擬南芥對鎘離子的耐受性。結果發現,導入玉米同源基因后,擬南芥對高濃度鎘離子的耐受性增強,與非轉基因植株相比,根生長更長、嫩芽生長更快。

                                 

3. RNA-seq檢測差異表達基因
然后利用RNA-seq,檢測轉基因擬南芥和非轉基因擬南芥在鎘離子脅迫下基因表達的差異變化。差異表達分析結果顯示,共有30個差異表達基因在ZmOXS2b與ZmO2L1轉基因植株共有(維恩圖交集部分),這些基因在兩種轉基因植株中表達模式相似(圖B)。其中14個基因與應激、金屬離子運輸相關。


備注:作者給這30個DEG從1-30命名了。

4. qPCR驗證RNA-seq結果
對這30個共有DEG進行qPCR驗證,其中8個DEG與非轉基因植株相比,基因表達量變化最大(3.6~13.9倍)(上圖 C)。這8個DEG甚至在沒有鎘處理的情況下也會在轉基因植株中表達上調。
這8個DEG分別是:DEG7,DEG11,DEG19,DEG20,DEG21,DEG23,DEG24,DEG30

5. 體內體外實驗驗證ZmOXS2b和ZmO2L1激活DEG啟動子上的轉錄因子結合位點BOXS2 motif

得到了轉入玉米基因后表達量上調的基因后,那么下一步就要研究這兩個玉米OXS2基因是怎樣與擬南芥的靶向基因相互作用的。之前有報道指出,AtOXS2可通過結合一段富含CT的9bp長的motif來激活啟動子,這段motif稱為BOXS2。那么,我們可以猜測,玉米OXS2基因可能也是通過轉錄因子結合的方法,激活下游靶向基因的表達的。因此,對上一步得到的8個DEG進行轉錄因子結合位點計算機預測,發現DEG11,DEG21,DEG23的啟動子區都含有潛在的BOXS2轉錄因子結合序列。然后作者通過體外熒光素酶報告基因實驗和體內ChIP-qPCR實驗,來驗證計算機預測的結果,驗證ZmOXS2b和ZmO2L1是否是通過結合BOXS2 motif來激活啟動子的。

體外熒光素酶報告基因實驗:將8個DEG的啟動子與熒光素酶報告基因融合(圖A)

體內ChIP-qPCR實驗:擬南芥中導入含有FLAG標簽的ZmOXS2b和ZmO2L1,然后用FLAG抗體共沉淀,并qPCR驗證DNA表達量(圖B)

結果:體外實驗和體內實驗的結果都發現,只有這三個含有BOXS2  motif的DEG的結果為陽性,說明ZmOXS2b和ZmO2L1是通過轉錄因子的方式,結合BOXS2元件,從而激活下游靶向基因的啟動子。這結果也說明實驗驗證的結果與計算機預測的結果高度一致。

6. 過表達8個DEG檢驗能否增強擬南芥對鎘離子的耐受性
然后作者構建了這8個DEG的過表達載體,轉入擬南芥中過表達這些基因,發現只有DEG23能夠增強擬南芥對鎘離子的耐受性,并且只過表達DEG23已經能夠增強擬南芥對鎘離子的耐受性了,說明這個基因在緩解鎘離子毒性中起著很重要的作用。
DEG23編碼一個甲基化轉移酶,因此被命名為CIMT1。(在CIMT1過表達系,CIMT1表達量上調了14-17倍) 

7.驗證ZmOXS2b和ZmO2L1確實是通過結合BOXS2序列來激活CIMT1啟動子的
秉著嚴謹的科學態度,作者又在目標基因CIMT1啟動子上設計了四對引物(如下圖), 進行ChIP-qPCR來檢驗ZmOXS2b和ZmO2L1是否通過結合BOXS2序列來激活CIMT1啟動子。

結果:
只有包含了BOXS2 motif(圖中黑色部分)的F12和F20引物對的ChIP-qPCR結果是陽性的,說明ZmOXS2b和ZmO2L1確實是通過結合BOXS2序列來激活啟動子,并且這種作用并不依賴于鎘離子(也做了不加鎘的處理,結果同樣是陽性)。

總結:
其實這兩個玉米氧化應激蛋白,就是轉錄因子,文章通過將這兩個同源基因導入擬南芥,在模式生物中研究這兩個轉錄因子的下游靶向基因,通過計算機預測、體內體外實驗,逐步縮小范圍,最終找到了一個靶標基因CIMT1,這個基因啟動子上的BOXS2 motif可以結合玉米轉錄因子,從而被激活表達,緩解鎘離子對植株的毒性。

展望:
其實玉米才是這個實驗室的目標研究作物。這篇文章找到擬南芥CIMT1基因后,作者展望了可以通過找出CIMT1在玉米中的同源基因,然后研究這個同源基因能否在玉米鎘離子脅迫中也發揮相似的作用。

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